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          ibidi實(shí)驗(yàn)方案|腫瘤細(xì)胞2D侵襲檢測(cè)方案

          更新時(shí)間:2022-08-02   更新時(shí)間:2022-08-02   點(diǎn)擊次數(shù):1264次

            為了研究腫瘤微環(huán)境影響下腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲特性,建立了體外2D侵襲方案。

            

            2D侵襲方案是一種共培養(yǎng)試驗(yàn),在這種情況下,是由腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞)組成的。一旦兩種細(xì)胞類型接觸,在不同的條件下評(píng)估侵襲成纖維細(xì)胞單層的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量,在我們的研究中,我們?cè)谀M實(shí)體腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的條件,例如與基質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)的相互作用以及成纖維細(xì)胞釋放的可溶性因子(Nnetu等,2012)。我們使用A375黑色素瘤細(xì)胞系和真皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行了此測(cè)定。黑色素瘤細(xì)胞激活成纖維細(xì)胞,繼而維持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),惡性轉(zhuǎn)化和耐藥性(Flach等,2011)。然而,在刺激所測(cè)試的抗癌化合物后,我們發(fā)現(xiàn)與成纖維細(xì)胞直接接觸的黑素瘤細(xì)胞顯示出運(yùn)動(dòng)能力受損并且未能侵襲成纖維細(xì)胞層。

            

            ibidi腫瘤細(xì)胞2D侵襲檢測(cè)方案實(shí)驗(yàn)流程:  

            01. 將GFP-A375和番茄成纖維細(xì)胞系穩(wěn)定地保存在MEF培養(yǎng)基中,在37°C和5%C02加濕培養(yǎng)箱中。  

            02. 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到亞融合度(約80%融合度)時(shí),在帶有PBS的通風(fēng)櫥中清洗它們,以去除死細(xì)胞和碎片。  

            03. 在培養(yǎng)箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化細(xì)胞約5分鐘,然后添加MEF培養(yǎng)基以阻止反應(yīng)。  

            04. 將細(xì)胞懸浮液收集在15ml細(xì)胞培養(yǎng)管中,并用臺(tái)式離心機(jī)(1500xg,5′,RT)短暫離心。  

            05. 將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中;將一體積的細(xì)胞懸液與另一體積的臺(tái)盼藍(lán)溶液混合,用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)活細(xì)胞。 

            06. 在MEF緩沖液中以4x105細(xì)胞/ml的濃度稀釋細(xì)胞。  

            07. 在多孔板上,在每個(gè)孔的中間放置一個(gè)Culture-Insert2孔(2孔培養(yǎng)插件)。  

            08. 用75µl(3x104細(xì)胞)FP-A375細(xì)胞填充插入物一側(cè),并用番茄成纖維細(xì)胞填充另一側(cè)。用移液器上下混合插入物中的細(xì)胞,以確保細(xì)胞*分布。  

            09. 將多孔板放在培養(yǎng)箱中,放置過夜。  

            10. 第二天,在鑷子的幫助下,小心地從每孔中取出培養(yǎng)基和插件,并用PBS清洗。  

            11. 小心除去PBS,然后加入新鮮的MEF培養(yǎng)基。 

            12. 用光學(xué)顯微鏡檢查GPF-A375與Tomto成纖維細(xì)胞之間產(chǎn)生的間隙的閉合狀態(tài)。  

            13. 一旦每個(gè)孔中的間隙*閉合,請(qǐng)使用熒光顯微鏡和成像軟件獲取熒光圖像。確保腫瘤細(xì)胞尚未侵入成纖維細(xì)胞單層。 

            14. 小心地除去培養(yǎng)基,并在控制組孔中添加培養(yǎng)基+0.1%PBS,在處理組孔中添加培養(yǎng)基。將板放在培養(yǎng)箱中24小時(shí)(處理孵育時(shí)間)。  

            24小時(shí)后,在熒光顯微鏡下重新采集共培養(yǎng)孔,以評(píng)估治療組與對(duì)照組(綠色熒光細(xì)胞散布在紅色標(biāo)記層上)的腫瘤細(xì)胞侵襲行為的任何變化。


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            將黑素瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng),然后暴露于300nmMithramycinA(或DMSO)。24小時(shí)后,評(píng)估侵襲成纖維細(xì)胞層的腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。A375細(xì)胞顯示出大規(guī)模的侵襲行為,受到MithramycinA治療的損害。比例尺:500μm。

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