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          ibidi|腫瘤學(xué)血管生成實驗的操作過程

          更新時間:2022-09-09   更新時間:2022-09-09   點擊次數(shù):1244次

            此次實驗是以HUVEC細胞為例,來介紹腫瘤學(xué)血管生成實驗的操作過程這一實驗的詳細過程。

            

          1.png

          圖一  血管生成鏡檢圖


            實驗步驟:


            1、準(zhǔn)備基質(zhì)膠  

            1)實驗前一天將Matrigel置于冰盒中,放入4℃冰箱,使膠能過夜緩慢融化。(注意:同樣要準(zhǔn)備一些4℃預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel)  

            2)開始實驗前,將Matrigel始終保持放在冰盒中。  

            3)打開滅菌包裝,取出ibidi血管生成載玻片。  

            4)每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

            

          6.png

            

            由于Matrigel流動性不強,并且有可能移液槍不準(zhǔn)確,有可能打入10μl的膠,卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣,必然會影響到實驗的成像結(jié)果。

            

            如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel:  

            我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

            

          7.png

            

            如上圖所示,垂直透過每個孔看下面的格子紙,如果格子被縮小了,那么就說明膠沒加滿,格子被放大了,那么膠就加多了,格子沒發(fā)生什么變形,這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

            

            2  凝膠 

            1)蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。  

            2)準(zhǔn)備一個10cm的培養(yǎng)皿,放入浸過水的紙巾,制成一個濕盒。  

            3)將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中,蓋上培養(yǎng)皿蓋。  

            4)將整個培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中,靜置30分鐘左右,等待膠凝結(jié)。  

            5)等待同時準(zhǔn)備細胞懸液。

            

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            3  鋪細胞 

            加入細胞的量直接影響實驗結(jié)果,所以在正式實驗開始之前,要對不同類型的細胞和使用數(shù)量進行預(yù)實驗。獲得最佳比例的細胞密度。我們今天的實驗使用HUVEC細胞,每孔種10000個細胞即可。  

            1)準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細胞懸液,充分混勻。  

            2)將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。  

            3)每孔加入50μl的細胞懸液,注意保持槍頭垂直在上孔的上方,不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。  

            4)同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體,如果沒有,加入無細胞的培養(yǎng)基,使上孔液體正好加滿。  

            5)蓋上蓋,靜置,一段時間后,所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面。

            

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            4  采集圖像并統(tǒng)計結(jié)果  

            可以按照細胞的生長速度定時采集圖像,并且對其成管長度,覆蓋面積,成環(huán)數(shù),結(jié)點數(shù)進行測量和記錄,并且對其進行統(tǒng)計分析。

            

          10.png

            

            5  免疫熒光染色  

            根據(jù)需要,可以對成管結(jié)果進行免疫熒光染色。 


          11.png


            1)小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基,注意不要碰到膠或者細胞網(wǎng)絡(luò)。  

            2)加入50μl用無血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl),使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)。 

            3)在室溫下避光孵育30分鐘。  

            4)使用PBS清洗三次,注意,PBS要緩緩加入上孔,以免沖擊掉細胞。  

            5)使用 485 nm/ 529 nm進行免疫熒光成像。 

          聯(lián)


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