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          ibidi免疫熒光實(shí)驗(yàn)|可移除腔室載玻片對細(xì)胞的培養(yǎng)固定染色

          更新時(shí)間:2023-05-22   更新時(shí)間:2023-05-22   點(diǎn)擊次數(shù):1328次

            ibidi3孔可移除腔室載玻片可對MCF-7細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、固定和染色,為其免疫熒光實(shí)驗(yàn)提供一種簡單且經(jīng)濟(jì)高效的方案。

            

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            實(shí)驗(yàn)使用材料:  

            此次實(shí)驗(yàn)所需使用的材料和試劑如下所示。此外,還需要配備一臺有適當(dāng)濾光片組的倒置或正置熒光顯微鏡。  

            

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            ·3孔可移除腔室載玻片(ibidi,80381)  

            ·3孔可移除培養(yǎng)專用圓形15mm蓋玻片及配套工具,(ibidi,10815) 

            ·細(xì)胞:MCF-7(CLS,300273)  

            ·細(xì)胞培養(yǎng)基  

            ·細(xì)胞培養(yǎng)試劑 

            ·PBS  

            ·福爾馬林中性緩沖液,10%(Sigma,HT5011) 

            ·染色試劑:DAPI(Sigma,D954)、DYE-490鬼筆環(huán)肽(Dynomics,490-33) 

            ·封片劑:FluoroshieldTM(Sigma,F(xiàn)6182)

            

            實(shí)驗(yàn)操作解決方案:細(xì)胞培養(yǎng),固定,染色和成像觀察--都是在一個開放型小室中搞定:  

            

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            第1步:必須在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定細(xì)胞系的正確接種濃度。根據(jù)您的細(xì)胞類型,用2-6x104細(xì)胞/ml在2-3天內(nèi)產(chǎn)生匯合的單層。  

            1. 在無菌條件下,打開3孔可移除腔室載玻片(ibidi,80381)包裝。  

            2. 像往常一樣對細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶化和計(jì)數(shù)。MCF-7細(xì)胞濃度為3×104細(xì)胞/ml 。  

            3. 將1100μl細(xì)胞懸浮液加入腔室的每個孔中。避免搖晃,因?yàn)檫@會導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。為獲得更均勻的細(xì)胞分布,請使用3孔可移除培養(yǎng)專用圓形15mm蓋玻片。  

            4. 用配套的蓋子蓋住。在37°C和5%CO2下培養(yǎng)。  

            5. 細(xì)胞至少培養(yǎng)24小時(shí),或直到建立融合的單層。  

            

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            第2步:固定是染色程序的第一步。目的是將細(xì)胞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織維持在當(dāng)前狀態(tài),并通過化學(xué)試劑在較長時(shí)間內(nèi)保存制劑。  

            1.小心地抽吸細(xì)胞培養(yǎng)基。  

            2.用PBS洗兩次。  

            3.加入1100μl福爾馬林溶液。  

            4.室溫下孵育30分鐘。  

            5.小心地抽吸福爾馬林溶液。  

            6.用PBS洗滌三次  

            

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            第3步:應(yīng)根據(jù)感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核和肌動蛋白骨架。  

            1.準(zhǔn)備你的染色溶液:PBS、DYE-490鬼筆環(huán)肽(每單元/玻片,50 μl/單元)、DAPI 1μg/ml  

            2.小心吸出PBS。  

            3.用蓋玻片拾取工具抓取15毫米的圓形蓋玻片,并將其放置在腔室孔內(nèi)的圓形邊緣上。  

            4.將移液管-尖-端-插入其中一個角槽中,將150μl染色液移入孔中。  

            5.在室溫下避光孵育30分鐘  

            

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            第4步:染色后清洗樣本可最大限度地減少背景信號  

            1.通過在一個角槽中添加950μl緩沖液來移除蓋玻片。  

            2.用Coverslip Pick-Up Tool蓋玻片拾取工具或鑷子抓取漂浮的蓋玻片,將其從孔中取出。  

            3.如有必要,重復(fù)洗滌步驟,抽吸緩沖液并在每孔中移液1100μl緩沖液。圓形的15毫米蓋玻片無需額外的洗滌步驟。 


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            第5步:從一個邊緣開始,用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈。該步驟應(yīng)以緩慢,穩(wěn)定的進(jìn)行,以避免損壞細(xì)胞層。

            

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            第6步:完成染色程序后,必須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還可防止樣品脫水。  

            1.將載玻片側(cè)面在干凈的實(shí)驗(yàn)室濕巾上輕敲,去除樣品中多余的介質(zhì)。  

            2.將封固劑涂在樣品上。用24 x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝好的樣品,小心地將蓋玻片放到封片劑上,以避免夾住任何氣泡。  

            Tip:建議使用硬化封片劑,如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)。  

            3.等封片劑固定好。


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            第7步:顯微觀察  

            使用可移除3孔腔室載玻片培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞。用DAPI和染料490對細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色。圓形15mm蓋玻片減少了所需的染色溶液的量。用硬化封片劑安裝載玻片,可使樣品長期保存。  

            

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            圖1 MCF-7細(xì)胞的肌動蛋白骨架用DYE 490鬼筆肽染色(左上),細(xì)胞核用DAPI染色(右上)。下圖顯示了合成圖像,細(xì)胞核為藍(lán)色,肌動蛋白骨架為綠色。(比例尺:100μm)

            

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