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          ibidi活細胞共聚焦成像|探索更深的細胞組織的內(nèi)部!

          更新時間:2023-07-19   更新時間:2023-07-19   點擊次數(shù):1011次

            激光共聚焦顯微鏡可以觀察到細胞內(nèi)已經(jīng)標(biāo)記好的蛋白質(zhì)和分子,為生物學(xué)研究提供了更直觀的觀測方法。那在細胞實驗中,如果要進行一次激光共聚焦成像,都有哪些操作方法可實驗應(yīng)用。

            

            傳統(tǒng)實驗操作方法:

            

            由于激光共聚焦實驗對觀測耗材的底部有著比較高的要求,普通的培養(yǎng)皿,培養(yǎng)板或者培養(yǎng)瓶都不能直接用于激光共聚焦成像。

            

            1.比較常用的是使用170μm左右厚度的蓋玻片作為激光共聚焦成像的細胞載體。但是使用蓋玻片,如果買的是國產(chǎn)的蓋玻片,需要先做的一步是將蓋玻片清洗并且烘干滅菌,才能開始使用。

            

            2.進口的細胞爬片,雖然不需要清洗,但是還是需要進行包被才能讓細胞正常貼壁生長。通常是將處理好爬片直接放在多孔板中,然后鋪細胞,熒光染色后,再用鑷子將爬片拿出,反過來放在滴有封片劑(甘油配置)的載玻片上,再進行成像。如圖1所示:  

            

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          圖1:使用蓋玻片和細胞爬片的做免疫熒光方法示意圖

            

            實驗操作流程:

            

            1.蓋玻片需用濃硫酸浸泡過夜,第二天用自來水沖洗20遍,置于無水乙醇中6小時,后用三蒸水沖洗3遍,再放在飯盒或玻璃培養(yǎng)皿中烘干,消毒,再烘干后放入超凈臺備用。

            

            2.準(zhǔn)備好的蓋玻片或者專業(yè)的細胞爬片需要根據(jù)細胞的貼壁情況使用多聚賴氨酸等蛋白包被。

            

            3.培養(yǎng)板中放置爬片非常有技巧,要將爬片與培養(yǎng)板底部緊密貼合,這樣才能避免長成雙層細胞。

            

            4.常規(guī)免疫熒光操作后,取出爬片。準(zhǔn)備載玻片一張,在中間滴加適量的封片劑(甘油配置),將蓋玻片或爬片翻過來,蓋在封片劑上,再用指甲油封片進行成像。

            

            5.在激光共聚焦成像之前,盡量用熒光顯微鏡檢查一下細胞狀態(tài)和成像效果,再去做激光共聚焦,畢竟做一次激光共聚焦的成像也不便宜的。

            

            ibidi無需爬片的簡便方法:

            

            ibidi實驗應(yīng)用,大大簡化了樣品準(zhǔn)備流程,但需要用到專為共聚焦實驗設(shè)計的共聚焦培養(yǎng)皿,例如ibidi的共聚焦培養(yǎng)皿ibidi 81156,ibiTreat底部處理。


            這款共聚焦培養(yǎng)皿的底部是polymer聚合物材質(zhì),具有親水表面,可讓大多數(shù)種類的細胞都可以直接貼壁,無需另外進行包被;同時,它們的底部符合蓋玻片標(biāo)準(zhǔn)——厚度僅為180μm,在折射率,阿貝系數(shù)上,它們的性能和標(biāo)準(zhǔn)爬片一致,再加上極低的自發(fā)熒光和細胞可以直接貼壁的特性,使它們成為共聚焦成像的專用培養(yǎng)皿。所有的操作都在培養(yǎng)皿中進行,不再需要鑷子以及繁瑣的清洗,滅菌,包被程序(流程如圖2所示)

            

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          圖2:共聚焦專用培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備樣品流程,可以直接進行細胞培養(yǎng)-染色-成像操作(圖中使用的產(chǎn)品為ibidi 81156共聚焦培養(yǎng)皿)

            

            實驗操作流程:

            

            1.在超凈臺中打開無菌包裝的共聚焦專用培養(yǎng)皿,取出培養(yǎng)皿,加入細胞懸液,蓋上皿蓋,放入培養(yǎng)箱中靜置,等待細胞貼壁。常規(guī)細胞培養(yǎng),待細胞長置合適密度再取出,進行免疫熒光染色。

            

            2.吸出培養(yǎng)基,以PBS清洗細胞,再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定細胞。

            

            3.20分鐘后,吸出固定液,加入0.1%Triton X-100

            

            4.10分鐘后,吸出Triton,清洗細胞后加入BSA封閉。

            

            5.加入抗體熒光染色后,吸出所有試劑,加入封片劑,可以開始共聚焦顯微成像。

            

            使用共聚焦培養(yǎng)皿還有個好處:往往一個共聚焦掃描成像持續(xù)時間很長,培養(yǎng)皿中的液體非常容易揮發(fā),共聚焦培養(yǎng)皿有皿蓋,可以減少揮發(fā);如上述提到的ibidi共聚焦培養(yǎng)皿,有個巧妙的鎖扣設(shè)計,可以扣緊培養(yǎng)皿,確保在共聚焦成像的過程中,皿中的液體不會揮發(fā)(如圖3)。  

            

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          圖3:ibidi共聚焦培養(yǎng)皿的鎖扣設(shè)計 

            

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            ibidi共聚焦皿方法的應(yīng)用優(yōu)勢。一個培養(yǎng)皿完成細胞培養(yǎng)-染色-成像等系列操作,無需包被,無需爬片,操作簡便;在培養(yǎng)皿里的操作對于操作技術(shù)的要求相對更低,也更便捷;培養(yǎng)皿可使用皿蓋減少蒸發(fā),杜絕揮發(fā)對成像的影響。

            

            ibidi培養(yǎng)皿信息:


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